JACS: عقدت Merck شراكة مع Huanquan وConquer Biotech للكشف علنًا عن عملية التوليف الإجمالية لـ MK-0616.

01 خلفية البحث والتطوير وتحدياته

1.1 خلفية تطوير الدواء لـ MK-0616

يعد Enlicitide Decanoate (المعروف أيضًا باسم MK-0616) أول مثبط PCSK9 للببتيد الحلقي الكلي عن طريق الفم مصمم بالكامل من جديد والمخصص لتقليل كوليسترول البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL-C) وعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية المرتبطة بتصلب الشرايين.

كما هو موضح في الشكل أعلاه، بالإضافة إلى MK-0616، تشمل الأمثلة الكلاسيكية في هذا المجال أيضًا المضاد الحيوي فانكومايسين (2)، وعامل العلاج الكيميائي باكليتاكسيل (3)، والدواء المضاد للسرطان الإيبيولين (4). إن التركيبات المعقدة للمركبين 2 و3 تعني أن تركيبها الفعلي لا يزال يعتمد على طرق شبه اصطناعية تعتمد على المنتجات الطبيعية؛ وفي المقابل، حقق فريق إيساي التركيب الكلي للمركب 4 من خلال أكثر من 60 خطوة، مما يمثل علامة فارقة في تركيب مركبات البوليكيتيد.

فيما يتعلق بـ MK-0616، فإن تركيبه الكيميائي فريد للغاية: فهو أول جزيء مصمم بالكامل من الصفر (وليس مشتقًا من مصادر طبيعية)؛ علاوة على ذلك، باعتباره مثبطًا فمويًا يوميًا لـ PCSK9 مخصصًا لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية وليس لعلاج الأورام أو التطبيقات المضادة للعدوى، فإن الطلب العالمي عليه سيتجاوز بكثير طلب الأدوية التقليدية المبتكرة، مما يستلزم إنتاجه على نطاق يتراوح من مئات الكيلوجرامات إلى عدة أطنان.

1.2   التحديات والاستراتيجيات الاصطناعية

يفرض التعقيد الجزيئي لـ MK-0616 متطلبات صارمة على تطوير العملية.

الخصائص الهيكلية: على الرغم من أن MK-0616 ينشأ من ببتيد حلقي كبير تم تحديده من خلال فحص تقنية عرض mRNA، فإنه يحتوي على 6 أحماض أمينية غير أساسية (إجمالي 8 وحدات من الأحماض الأمينية)، وحلقة كبيرة مكونة من 37 عضوًا، وسلسلة جانبية لملح الأمونيوم (10)، وجزء غير ببتيد (13)، مما يجعل تقنيات تخليق الببتيد في الطور الصلب التقليدية غير فعالة تمامًا، كما هو موضح أدناه.

التحديات الأساسية التي يتعين معالجتها

1、استقرار الوسطيات القطبية (خاصة بالنسبة لشظايا أملاح الأمونيوم، حيث يجب التحكم في العداد طوال العملية برمتها)；

2、انتقائية إغلاق الحلقة الكبيرة (يتطلب تحسين تسلسل التجميع بين 10 كتل)；

3、تحديات التوسع (تجنب التنقية الكروماتوغرافية؛ وضمان إنتاجية مقياس من مليجرام إلى كيلوجرام)；

لذلك, القرار الرئيسي الذي اقترحه الباحثون هو كما يلي：

1、فرق تسد：إعطاء الأولوية لبناء "الجزء الشمالي" (حلقة مكونة من 17 عضوًا تتكون من أحماض أمينية غير قانونية في المواضع 5 و6 و7)، وتبسيط استراتيجية الانقسام الحلقي الكبير من خلال التحليل الرجعي (على سبيل المثال، عن طريق اختيار رابطة أميد بين المواضع 5 و 8).

2、مقدمة السلسلة الجانبية الطرفية：يجب حجز جزء ملح الأمونيوم القطبي (10) لخطوة التثبيت النهائية لتجنب التحديات المرتبطة بالتنقية الوسيطة.

3、التطبيق المرن للحمض–تفاعلات تحييد القاعدة (RCM)：يتم تشكيل سلسلة مرتبطة بـ n-hexane في المواضع 7–13؛ يُظهر رد الفعل هذا تعامدًا ممتازًا ويمكن تنفيذه على مراحل متعددة.

ومن خلال هذه السلسلة من الاستراتيجيات، أنشأ الباحثون في نهاية المطاف طريقًا اصطناعيًا قابلاً للتطوير، مما يمهد الطريق للتقييم السريري.02

02 الاستراتيجية الاصطناعية والتحسين

من خلال الدراسات التحليلية، أجرى الباحثون تحسينًا متعدد الخطوات ومتعدد الأجيال للجزء الحلقي الكبير الرئيسي (الجزء الشمالي) وقاموا بتحسين تجميع الجزء الجنوبي مع المنتج النهائي.

2.1 التحسين متعدد الأجيال للجزء الشمالي:

الجيل الأول– 37 التكرارات

يُظهر تخليق الأحماض الأمينية غير الأساسية (على سبيل المثال، 3-هيدروكسي برولين) كفاءة منخفضة، لأنه يعتمد على تفاعلات التدوير غير الفعالة—مثل تكثيف ديكمان—وكذلك القرار اللولبي. علاوة على ذلك، تتطلب هذه العملية جولات متعددة من معالجة مجموعة الحماية والعديد من عمليات التنقية الكروماتوغرافية، كما هو موضح في الشكل أدناه.

كل هذه العوامل تحد من التوليف على نطاق واسع للأجزاء المستهدفة.

نظام متزامن من الجيل الثاني

تم تحقيق اختراق من خلال التحفيز الحيوي: أدى إدخال تقليل الكيتون (KRED) إلى تمكين التخفيض عالي الكفاءة والانتقائي المجسم لـβ-هيدروكسيسترات؛ بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام إنزيم TrpB المُصمم هندسيًا لتخليق التربتوفان المفلور، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى التحليل اللولبي. ونتيجة لذلك، تم تقليل عدد الخطوات الاصطناعية، وتقليل استخدام مجموعات الحماية، كما هو موضح في الشكل أدناه.

تم أيضًا تطبيق هذا الطريق الاصطناعي لتحسين الجزء الشمالي في التطوير السريري؛ ومع ذلك، فإن الفرص الناشئة عن الاستراتيجية الهيكلية خلقت حاجة لمزيد من التحسين لمسار تركيب الأجزاء.

أولاً، توفر النتائج الرئيسية المتعلقة بوسائل التبلور الثلاثة المتأخرة نقطة حرجة للتحكم في النقاء؛ ولذلك، فمن الضروري تعديل المسار الاصطناعي لاعتراض هذه الوسائط الثلاثة.

ثانياً، يوصى بإجراء عملية التثليث الحلقي لتفاعل الأوليفينات في وقت متأخر قدر الإمكان أثناء عملية التوليف. يعتمد هذا النهج على اعتبار أن محفزات الروثينيوم قد تزيد من التكلفة الإجمالية لإنتاج البنزوثيورامين؛ وبالتالي فإن إجراء هذا التفاعل في المرحلة النهائية من المسار الاصطناعي يمكن أن يقلل التكاليف بشكل كبير.

ولذلك، فقد سهل هذا تحسين نهج الجيل الثالث.

نظام الخطوات المشتركة من الجيل الثالث

من خلال الهيدروكسيل الأنزيمي، يتأكسد L-proline مباشرة إلى 3-hydroxyproline مع انتقائية مجسمة تتجاوز 99:1؛ تم تحديد المواد الوسيطة الرئيسية، مثل تبلور ملح بنزين سلفونات، مما مكن من تجنب التنقية الكروماتوغرافية؛ تم استخدام التجميع المعياري، إلى جانب التعديلات على تسلسل اقتران الأحماض الأمينية وتبسيط استراتيجية مجموعة الحماية، كما هو موضح في الشكل أدناه.

يختلف الجزء الشمالي الاصطناعي من الجيل الثالث MK-0616 عن الأجزاء التي تم تصنيعها في الجيلين السابقين. كان الدافع وراء هذا الاختيار هو تحديد البنتانوات البلورية 91، التي تفتقر إلى بقايا الحمض الأميني ثريونين (سيتم دمجها لاحقًا أثناء عملية التوليف). يمكن عزل هذا الملح بإنتاجية عالية ونقاء ويوفر وسيطًا عالي الاستقرار يمكن تخزينه كوسيط رئيسي طوال عملية التخليق.

من خلال التحسين في الجيل الثالث، أصبح فصل الجزء الشمالي المصمم حديثًا (91) يتطلب الآن 14 خطوة فقط—فقط ثلث عدد الخطوات المطلوبة لتوليف الجيل الأول. علاوة على ذلك، من المهم ملاحظة أنه في بروتوكول الجيل الثالث، تم تقليل أطول تسلسل خطي بأكثر من النصف، حيث انخفض من 20 خطوة إلى 9 خطوات.

2.2 تحسين الجزء الجنوبي

الجيل الأول، ويتكون من 15 خطوة

بدءاً من المواد الخام التي يتم شراؤها بكميات كبيرة من الموردين التجاريين، تمثل العملية المكونة من 9 خطوات أطول تسلسل خطي، كما هو موضح في الشكل أدناه.

نظام متزامن من الجيل الثاني

في تركيب الجيل الثاني، ما تم تحسينه لم يكن عدد الخطوات، بل التحكم في الكفاءة والنقاء بشكل عام، كما هو موضح في المخطط أدناه. وبعد آلاف التجارب، تم التعرف على جزء من اللطخة الجنوبية يسمى ملح الليلامين (99).

سبق أن ثبت أن استخدام هذين المركبين يعمل كمذيبات غير كيرالية للأحماض الكربوكسيلية؛ وبالتالي، يمكن الحصول على الملح البلوري (99) بشكل مفاجئ كمادة عالية النقاء، وبالتالي تجنب العمل التحضيري المكثف لـ HPLC المطلوب في الجيل السابق من التوليف.

2.3 التجميع النهائي للمنتج

يمكن حماية كل من الجزء الشمالي من الجيل الأول والجزء الوسيط الثاني من الجزء الجنوبي بسهولة لإنتاج السلائف الخطية 61، كما هو موضح في الشكل أدناه؛ ومع ذلك، فإن عائد منتج استبدال السيكلوليفين منخفض جدًا.

بغض النظر، نجح الباحثون في استخدام تسلسل آخر، مما أتاح أول تخليق قابل للتطوير لـ MK-0616، كما هو موضح في المخطط أدناه.

تم تصنيع أملاح إنالدهيد الجيل الأول من خلال عملية مكونة من 63 خطوة تبدأ بتركيب سلاسل جانبية على القلب الجزيئي من خلال وسط عالي الإنتاجية يتبعه تنقية SFC؛ ومن بين هذه الخطوات، تمثل الخطوة 28 أطول تسلسل خطي.

يظهر الشكل أدناه مجموعة المنتج النهائي للجيل الثاني.

من خلال تحسين المسارات لكل من الأجزاء الشمالية والجنوبية التي تستهدف المنتج المستهدف، يمكن لكلا النهجين استخدام الوسائط البلورية المسطحة للتقدم إلى المرحلة النهائية من التوليف.

يعتبر تفاعل الاقتران هذا نظيفًا بدرجة كافية للانتقال مباشرةً إلى الخطوة التالية باستخدام تفاعل خام.

بشكل عام، يتطلب المسار الاصطناعي من الجيل الثاني لـ MK-0616 43 خطوة، من بينها 21 خطوة تشكل أطول تسلسل خطي. يؤدي هذا التسلسل إلى تقليل إجمالي عدد الخطوات وطول أطول تسلسل خطي مقارنة بعملية الجيل الأول بمقدار الثلث.

03 مفتاح الابتكار التكنولوجي

يكشف تحليل عملية التحسين بأكملها عن العديد من الابتكارات في التقنيات الرئيسية، مثل:

1、تكنولوجيا التحفيز الحيوي:الدقة الحركية الديناميكية KRED؛ تخليق إنزيم TrpB لنظائر التربتوفان؛ الإدخال المباشر لمجموعات الهيدروكسيل عبر هيدروكسيلاز البرولين؛ إلخ.

2. تنقية يحركها التبلور: خطوات وسيطة متعددة—مثل ميثيل سلفونات من شظايا اللطخة الشمالية أو ملح الليلامين في شظايا اللطخة الجنوبية—يتم استخدامها لتحقيق تنقية التبلور، وبالتالي التخلص من الحاجة إلى الأعمدة الكروماتوغرافية.

3. استراتيجية مجموعة الحماية المتعامدة: التبديل المرن بين مجموعات الحماية مثل Boc وNosyl لضمان انتقائية التفاعلات متعددة الخطوات.

4. اعتبارات الكيمياء الخضراء: تقليل استخدام محفزات المعادن الثقيلة (مثل محفزات الروثينيوم) ونقل تفاعل RCM إلى مرحلة لاحقة لخفض تكاليف الإنتاج.

04 ملخص وتوقعات
توضح هذه الورقة التكامل المرن بين التحفيز الحيوي والتوليف الكيميائي، مع التأكيد على الدور المحوري لعمليات البلورة واعتماد نهج التصميم المعياري - وبالتالي عرض منهجية منهجية تمتد من الاستكشاف المختبري إلى الإنتاج على نطاق صناعي. يمثل هذا العمل حالة نموذجية في مجال التخليق الجزيئي المعقد: فقد انخفض العدد الإجمالي للخطوات من 63 في بروتوكول الجيل الأول إلى 43 في بروتوكول الجيل الثاني، مع زيادة الغلة بما يقرب من 1000 ضعف، مما أتاح جدوى الإنتاج على نطاق طن. طوال العملية بأكملها، يتم التركيز الاستراتيجي على خطوة البلورة، وبالتالي تجنب التنقية الكروماتوغرافية - وهي ميزة تجعلها مناسبة للغاية للإنتاج على نطاق طن. علاوة على ذلك، توفر هذه الدراسة نموذجًا تقنيًا للمناهج الاصطناعية للببتيدات الحلقية الكبيرة المعقدة الأخرى.