تتيح شلالات التحفيز الحيوي تصنيع الببتيد كبير الحلقات Enlicitide

يُعد مثبط PCSK9 الفموي التجريبي من MSD، وهو إنليسيتيد ديكانوات (MK-0616)، أول مثبط PCSK9 الببتيد كبير الحلقات عن طريق الفم يُظهر انخفاضًا كبيرًا في LDL-C لدى البشر. تم تطوير Enlicitide من شاشة عرض mRNA للببتيدات أحادية الحلقة ثم تم تثبيته لاحقًا من خلال روابط متقاطعة غير ببتيدية لإنشاء هيكل يشتمل على ثلاث دورات كبيرة مندمجة. يحتوي هذا الثماني الببتيد المعقد على ستة أحماض أمينية غير طبيعية واثنين من الأحماض الأمينية البروتينية المرتبطة بـ 12 رابطة أميد ورابط سلسلة مركزي مكون من ستة كربون. يتطلب التوليف الكيميائي التقليدي 43 خطوة، ومعالجة مجموعة الحماية (ما يقرب من نصف الخطوات الاصطناعية)، والتنقية الكروماتوغرافية، وخطوة استبدال إغلاق الحلقة المحفزة بالروثينيوم المخفف للغاية، مما يحد من قابلية التوسع والاستدامة.

تطوير التصنيع الأنزيمي الكيميائي

طور علماء MSD عملية إنزيمية كيميائية موجزة ومتقاربة لتصنيع ديكانوات الإنليسيتيد (1) التي تم تمكينها عن طريق الاقتران المباشر للمونومرات بواسطة روابط الأحماض الأمينية، جنبًا إلى جنب مع ربط شظايا الببتيد التحفيزي الحيوي والدورات الكبيرة باستخدام الإستريزات ومختزلات الإمين.

الإنجازات الرئيسية

مجموعة متتالية من ثلاثة إنزيمات باستخدام أربطة ATP-grasp

- سلسلة ثلاثية الإنزيمات (اثنين من رابطة ATP-grasp المهندسة + إعادة تدوير ATP) تجمع رباعي الببتيد من الأحماض الأمينية غير المحمية. إن أربطة ATP-grasp (على وجه التحديد أربطة الأحماض الأمينية المعتمدة على ATP، AALs) هي إنزيمات تحفز تكوين رابطة أميد بين الأحماض الأمينية غير المحمية أو الببتيدات باستخدام ATP كمصدر للطاقة. تستمر آليتهم من خلال وسيط أنهيدريد مختلط، والذي يسمح بالاقتران المباشر دون الحاجة إلى مجموعات حماية على الأمين المحب للنواة أو متبرعي الأسيل المنشط. في هذه الدراسة، استخدم الباحثون إنزيم ATP-grasp ligase من Bifidobacterium Teenis (BaAAL) ومتغيرات هندسية (Trp-BaAALEng وPhe-BaAALEng) لتوسيع ثنائي الببتيد بشكل انتقائي مع اثنين من الأحماض الأمينية غير الطبيعية (نظائر التربتوفان والفينيل ألانين) في سلسلة من وعاء واحد. تحتوي هذه الأربطة على جيب إلكتروفيل ضيق مدفون يقبل الأحماض الأمينية المفردة ككتروفيلات (ركائز الطرف C) ولكن يمكن أن تستوعب الببتيدات الأطول مثل نوكليوفيلات N. هذه الانتقائية تجعلها مثالية لتجميع الببتيد المتسلسل والخالي من مجموعة الحماية من الطرف C إلى الطرف N. يتم إعادة تدوير الـ ATP المستهلك باستخدام كيناز متعدد الفوسفات (FbPPKWT) مع هيكساميتافوسفات غير المكلف باعتباره الجهة المانحة للفوسفات.

استريز هندسي (RsEstEng) ماكرولاكتاميز انتقائي

- يحفز الاستريز الهندسي (RsEstEng) عملية اللاكتاماز الكبيرة الانتقائية لتشكيل الجزء الشمالي (إنتاجية 73%، مقياس 52 كجم). يُشتق RsEstEng من إنزيم carboxylesterase من النوع البري (RsEst) الذي تم تحديده من Roseibacillus sp. وظيفتها الأصلية هي التحلل المائي لسندات استر. من خلال التطور الموجه، قام الباحثون بتحويله إلى محفز لللاكتاماز الماكروليتي الانتقائي - تشكيل رابطة أميد حلقية كبيرة - في تخليق الجزء الشمالي (4) من الإنليسيتيد. إنه يقبل إستر ثلاثي بوتيل المستقر والضخم لرباعي الببتيد الخطي (9) باعتباره الجهة المانحة للأسيل لإنتاج الببتيد الحلقي الكبير (4) لتكوين رابطة أميد داخل الجزيئات. لقد حقق تدويرًا انتقائيًا مع عدم وجود قليلات قليلة يمكن اكتشافها وفقط 0.8٪ منتج ثانوي للتحلل المائي للإستر، حتى في ظل ظروف القوة الأيونية العالية من السلسلة الأنزيمية السابقة.

ربط الثيوستيراز الهندسي (BlTEEng) بين الجزيئات

- يقوم إنزيم الثيوستيراز المُصمم هندسيًا (BlTEEng) بإجراء عملية ربط بين الجزيئات للأجزاء الشمالية (4) والشرقية (3) دون إجراء عملية التنظير. BlTEEng هو نسخة معدلة من مجال الثيوستيراز (TE) الذي تم استئصاله في الأصل من إنزيم الببتيد غير الريباسي (NRPS) من Brevibacillus Laterosporus (BlTE). عادةً ما تعمل إنزيمات الثيوستيراز البرية في أنظمة NRPS على تحفيز التدوير الكلي أو إطلاق الببتيدات الخطية من البروتين الحامل عبر رابطة الثيوستر. أظهرت المتغيرات الهندسية لـ BlTE بعض النشاط ولكنها فضلت المنتجات الثانوية الخافتة. حولت هندسة الإنزيمات الإنزيم لتحفيز الارتباط بين الجزيئات باستخدام أوكسوسترات الأيزوبروبيل الأكثر ثباتًا بدلاً من الثيوسترات الطبيعية القابلة للتحلل المائي.

أربعة إنزيمات متتالية أمينية اختزالية كبيرة

- سلسلة من أربعة إنزيمات (PsIREDEng، KsKREDEng، وإنزيمات إعادة تدوير العوامل المساعدة StLDHWT، TvADHWT) تحقق دورة كبيرة أمينية اختزالية لتكوين ديامين ثنائي الحلقة (إنتاجية 69٪، مقياس 46 كجم). KsKREDEng عبارة عن إنزيم كيتوريدوكتيز مصمم من شركة Kyrpidia sp. إنه يحفز أكسدة مركب الكحول البنزيلي (10) إلى ألدهيد عابر (11) يعتمد على NAD+. PsIRED هو إنزيم اختزال إيمين من Pseudogymnoascus sp. إنه يعتمد على NADPH. يحفز PsIREDEng الأمينة الاختزالية للألدهيد (11) والأمين الموجود لتكوين الإمين الحلقي (12)، يليه الاختزال إلى الأمين الثانوي الكبير (13). يقوم StLDHWT بتجديد NAD+ للخطوة التأكسدية عن طريق تقليل البيروفات إلى اللاكتات، بينما يقوم TvADHWT بتجديد NADPH للخطوة الاختزالية عن طريق أكسدة الأيزوبروبانول إلى الأسيتون.

التدوير الكلي النهائي عبر ثيوستيراز PBP المصمم هندسيًا

- الاقتران الكيميائي مع الجزء الغربي (2)، متبوعًا ببروتين ثيوستيراز البروتين المرتبط بالبنسلين (SsPBP-TEEng)، يغلق الدورة الكلية النهائية بتركيز عالٍ (70 جم/لتر) - متغلبًا على قيود التخفيف النموذجية (5 جم/لتر في التخليق التقليدي). تشتمل العملية الشاملة على ثلاث خطوات متتالية، و7 إنزيمات هندسية + 3 إنزيمات مساعدة، وإنتاج إجمالي بنسبة 39%، وعرض توضيحي على نطاق متعدد الكيلوجرامات، ونقاء >99%، بدون تحليل كروماتوغرافي، ولا توجد مجموعات حماية. يوفر هذا العمل مخططًا مستدامًا وقابلاً للتطوير لتصنيع الببتيدات الحلقية الكبيرة المعقدة، مما يقلل بشكل كبير من عدد الخطوات والنفايات مع تحسين الكفاءة ووصول المرضى.